Знаменская церковь находится на территории Лицейского сада. Это старейшее из зданий дворцового ансамбля. Первая деревянная церковь на участке, занимаемом ныне Знаменской церковью,— Успенская была построена в 1716 году. Здесь же 9 августа 1717 года в присутствии Петра I заложили новую деревянную церковь Благовещенскую. В 1728 году она сгорела от удара молнии.
В 1732 году Синод дал разрешение на постройку вместо сгоревшей деревянной каменной Знаменской церкви с тремя приделами. Закладка церкви состоялась 13 мая 1734 года. Проект разработал архитектор М. Г. Земцов, а наблюдение за строительными работами вел его ближайший помощник И. Я. Бланк.
В 1864—1865 годах Знаменскую церковь перестроил архитектор А. Ф. Видов. В 1892 году архитектор С. А. Данини пристроил к зданию церкви помещение «для высочайших особ». В дальнейшем, вплоть до Великой Отечественной войны, внешний облик здания не менялся.
Здание церкви представляет в плане прямоугольник, усложненный выступами алтарных абсид. Это небольшая трехнефная однокупольная базилика, причем средний неф, двухъярусный, освещается окнами в его продольных стенах. Боковые нефы одноэтажные. Торцевая западная стена среднего нефа в три оси завершается треугольным фронтоном. Над кровлей с западной стороны возвышается колокольня, увенчанная узким четырехгранным шпилем.
Плоскостная декорация фасадов пилястрами характерна для так называемого «аннинского барокко» 1730х годов. Масштабы здания и его членение на два яруса определили пропорции портика, пристроенного в 1773—1774 годах, по-видимому, архитектором А. Ринальди,—легкого и грациозного, поддерживающего балкон, огражденный железной кованой решеткой, исключительно изящной по рисунку.
Значительный историко-художественный интерес представляли интерьеры церкви, в особенности иконостасы главного и боковых приделов. В период фашистской оккупации города Пушкина здание церкви было разгромлено, иконостасы повреждены, иконы расхищены. Здание церкви реставрировано в 1960—1962 годах.